在实际使用时，为了获取较高的光子密度，一般会把飞秒激光准直后用物镜聚焦。目前，飞秒激光在单细胞层次上已经得到了广泛应用并得到了很多成果，它可以精确地蚀除单个细胞器如线粒体、细胞骨架以及神经细胞的一个微小区域。在组织层次上，飞秒激光的应用较少，主要依然是由于组织对于光传播较大的损耗限制了其应用。透明的眼角膜组织作为一种天然的适合光传播组织，首先被提出可以使用飞秒激光手术，用于近视矫正治疗。相较长脉宽的纳秒、皮秒激光来说，飞秒激光在临床应用上展现出了很大的优势。长脉宽激光需要达到较高的能量阈值才能发生光学击穿，而较大的能量会沉积于等离子体中，产生较大的冲击波和空化气泡二次效应，对靶组织造成较大的机械损伤。通过缩短脉冲可以在保持足够的峰值功率的同时降低脉冲能量。现在的飞秒技术聚焦于一个几微米的光斑的脉冲能量可以减小到微焦量级以下，这样就能大大减小冲击波和气泡二次效应。并且飞秒激光能量沉积到电子比电子热扩散快得多，所以电子的温度急剧升高导致介质直接汽化达到蚀除目的，同时热量又局限在聚焦体积内，限制了热扩散，对周围组织几乎不会造成热损伤。相较长脉冲激光而言，汽化的表面更加均匀平滑。

密歇根大学的Dr. Juhasz小组最先提出把飞秒激光应用于角膜手术，他们使用了电调制压缩的YAG飞秒激光器，激光参数为波长1064nm，脉宽500飞秒，重复频率1～10kHz，使用飞秒激光在角膜下层加工点阵，取代板层刀进行制瓣。1997年这个最早的研究团队在密歇根成立了Intralase公司，Intralase公司的脉冲飞秒激光器在2000年1月通过了美国FDA的认证，2001年引入市场和临床应用，现在最新第五代产品已经发展到了重复频率150kHz，可以在10秒钟以内完成制瓣。目前已经有四种飞秒激光系统被FDA批准进入市场，另外三种分别是德国的Femtec、瑞士的Femto LDV和德国蔡司的VisuMax。

尽管将飞秒激光应用于眼科临床手术减少了很多副作用和提高了安全及精确性，但还是存在一些问题，其中最主要的是手术过程中出现的不透明气泡层。如前所述，飞秒激光,在生物组织中的光爆破使得聚焦区域为一个气液共存状态，就会产生气泡，气泡如果不能及时消失继续堆积就会形成不透明的气泡层。在眼科手术时，如果不透明气泡处于中心并且密集可能会严重阻碍眼睛跟踪器的虹膜定位和瞳孔定位，影响手术效果。要想减小不透明气泡层的问题一方面需要调整激光的参数，比如寻找到最佳波长、最佳功率来减小脉冲能量，从而减小二次效应；另一方面是发展手术过程中比较好的引导气泡及时消失或排除的技术。从飞秒激光技术的角度来看，目前快速发展的光子晶体光纤飞秒激光器有望解决这个技术难点。